Ввод и редактирование текста

3. Методы идентификации грам(+) бактерий.

3.15. Желчные тесты.

Принцип. Колонии S.pneumoniae могут лизироваться в течение 30 минут под воздействием 10% дезоксихолата Na или желчи крупного рогатого скота.

Реагенты. 10% дезоксихолат Na(Sigma, Difco, США), 10% желчь крупного рогатого скота или диски, пропитанные 20% желчью.

Ход исследования.

1. Чашечный метод.

Þ На ограниченный участок чашки поверх колоний предполагаемого пневмококка (альфа-гемолитический стрептококк с колониями слизистой консистенции или характерным вдавленным центром) наносят 1-2 капли 10% дезоксихолата Na.

Þ Чашки помещают в термостат на строго горизонтальном положении дном вверх, слегка отодвинув в сторону крышку, и инкубируют при 35ºC в течение 2 ч.

Þ После высыхания реагента изучают участок, где был нанесен реагент, на наличие повреждения или лизиса колонии. При положительном результате может сохраниться лишь характерное для альфа-гемолиза окрашивание агара на месте бывшего нахождения колонии.

Альтернативный способ с желчными дисками.

Þ На выросшую культуру накладывают диск с желчью и инкубируют чашку в термостате 1-2 часа, затем учитывают результат.

Þ При положительном результате на 1-2 мм в окружности диска колонии пневмококка лизируются, а рост стрептококка остается интактным – отрицательный результат.

2. Пробирочный метод.

Þ Изучаемые колонии суспендируют в 1 мл 0,85% раствора NaCl по стандарту мутности 1,0 МакФарланда.

Þ Разделяют суспензию на две равные части, разливая в 2 маленькие стеклянные пробирки (12 х 75 мм).

Þ В одну, опытную пробирку добавляют 3-4 капли 10% дезоксихолата Na, в другую, контрольную – 3-4 капли 0,85% раствора NaCl и аккуратно смешивают.

Þ Инкубируют при 35ºC 2 часа, а затем учитывают результаты.

Þ При положительном результате происходит просветление мутной суспензии в опытной пробирке в сравнении с контролем.

Альтернативный способ.

Þ В 2 пробирки, содержащие 2-3 мл мясо-пептонного бульона с добавлением 10% желчи крупного рогатого скота (опыт) и без нее (контроль), вносят по 1 мл испытуемой бульонной культуры (вносимый объем зависит от интенсивности роста микроорганизмов).

Þ Инкубируют при 37ºC 1 час и затем учитывают результаты.

Þ При положительном результате культура пневмококка лизируется, что приводит к просветлению содержимого опытной пробирки по сравнению с контрольной.

Интерпретация результатов.

Лизис колонии на чашке или просветление суспензии в опытной пробирке с желчью или дезоксихолата Na расцениваются как положительный тест на пневмококк. Отсутствие лизиса (колонии остаются интактными) или просветления бактериальной суспензии свидетельствует об отрицательном тесте на пневмококк.

В качестве положительного и отрицательного контроля рекомендуется, соответственно, S.pneumoniae АТСС 6303 и S.agalactiae АТСС 13419 (или любой другой зеленящий стрептококк).

Ограничения и предосторожности.

1) Иногда альфа-гемолитические колонии в чашечном методе не лизируются, а лишь отделяются от поверхности среды, и перемещаются на какой-либо другой участок агара. Поэтому следует внимательно исследовать чашки и если такой дефект обнаружен, нужно повторить тест пробирочным методом.

2) Если получен сомнительный результат или отмечается лишь частичный лизис колонии, следует исключить наличие смешанной культуры.