Ввод и редактирование текста

3. Методы идентификации грам(+) бактерий.

3.2. Коагулазный тест.

Принцип. Коагулаза - термостабильный фермент, первоначально обнаруженный у S.aureus, но также продуцируемый S.intermedius и S.hyicus, которые довольно редко присутствуют в клиническом материале. Существует в 2-х формах: одна коагулаза связана с клеточной стенкой, другая – высвобождается клеткой в свободной форме. Связанная коагулаза или “хлопьеобразующий (clumping) фактор” действует непосредственно на фибриноген плазмы, вызывая склеивание бактерий. Свободная коагулаза действует на протромбин, формируя тромбиноподобный продукт, который затем воздействует на фибриноген с образованием сгустка фибрина. “Хлопьеобразующий фактор” определяют с помощью слайд-теста, который на 96% совпадает с пробирочным тестом (определение свободной коагулазы). S.schliferi и S.lugdunensis также продуцируют “хлопьеобразующий фактор”, но не вырабатывают свободную коагулазу, поэтому использование пробирочного теста позволяет дифференцировать их от S.aureus.

Реагенты. Используют коммерческую сухую кроличью плазму с цитратом натрия или EDTA (этилендиамин-тетрауксусная кислота).

1. Слайд-тест (“хлопьеобразующий фактор”).

Þ На стекло наносят 1 каплю кроличьей плазмы, суспендируют в ней бактериальные колонии и наблюдают за реакцией в течение 10 сек.

Þ Альтернативный способ: на стекле готовят густую суспензию культуры в дистиллированной воде, тщательно гомогенизируют, чтобы исключить спонтанное склеивание. Добавляют 1 каплю плазмы и, дополнительно не перемешивая, наблюдают за образованием хлопьев в течение 10 сек.

Þ Использование в качестве инокулума суспензии стафилококк-ков в физиологическом растворе, вместо бактериальных колоний, может привести лишь к излишнему разведению плазмы и ослаблению реакции.

Þ При положительной реакции образуются хлопья, которые не смешиваются в однородную суспензию (эталонным штаммом служит S.aureus АТСС 25923). При отрицательной реакции хлопья не образуются и суспензия остается гомогенной (в качестве эталонной культуры используют S.epidermidis АТСС 14990).

Ограничения и предосторожности.

1) Тест подходит только для штаммов стафилококка, которые не дают спонтанную аутоагглютинацию, а консистенция колоний не клейкая. Аутоагглютинирующие штаммы изучают в пробирочном тесте.

2) Нельзя использовать колонии с концентрированного солевого агара.

3) “Хлопьеобразующий фактор” присутствует у S.schliferi и S.lugdunensis, но для них более подходит не кроличья, а человеческая плазма.

2. Пробирочный тест.

Þ Засевают изолированную колонию стафилококка в пробирку с 0,5 мл кроличьей плазмы. (Пробирки с заранее разлитой плазмой могут храниться в холодильнике до 10 дней или в замороженном состоянии до нескольких месяцев.)

Þ Инкубируют при 35-37ºC до 24 ч.

Þ Первое наблюдение проводят через 4 ч инкубации на наличие желе или сгустка, который не разрушается при легком встряхивании.

Þ Если сгусток появляется через 4 часа, пробирки оставляют до следующего утра при комнатной температуре, чтобы избежать его растворения за счет стрептокиназоподобной активности исследуемой культуры стафилококка.

Þ Если сгусток отсутствует, посевы реинкубируют до 24 ч и затем исследуют повторно.

Þ Положительный результат – любое образование сгустка через 4 или 24 часа. При отрицательном результате сгусток не образуется и плазма свободно растекается при наклоне пробирки.

Ограничения и предосторожности.

1) Ложно положительный результат наблюдается при использовании цитратной плазмы со смешанной культурой стафилококка и бактерий, утилизирующих цитрат.

2) Ложно отрицательный результат наблюдается, если штамм продуцирует большое количество стафилокиназы, которая может растворить сгусток еще до учета реакции.