3. Методы идентификации грам(+) бактерий.

3.1. Каталазный тест².

3.2. Коагулазный тест.

3.3. Новобиоционовый тест.

3.4. Трегалоза-маннитол бульонный тест.

3.5. Окислительно-ферментативный тест с маннитом.

3.6. ДНК-азный тест³.

3.7. Лецитиназный тест.

3.8. Фосфатазный тест.

3.9. Гемолитический тест.

3.10. Бацитрациновый тест.

3.11. Иммунологические тесты.

3.12. CAMP-тест.

3.13. Гиппуратный тест.

3.14. Желчно-эскулиновый тест.

3.15. Желчные тесты.

3.16. Оптохиновый тест.

3.17. PYR(L-Pyrrolidonyl-b-Naphthylamide)-тест.

3.18. Тест толерантности к 6,5% NaCl.

К началу главы | Далее

3.6. ДНК-азный тест³.

Принцип. S.aureus продуцирует нуклеазу (ДНК-азу), вызывая деполимеризацию ДНК при ее добавлении в питательный агар, что выражается в образовании зоны просветления вокруг выросшей культуры. Этот признак полностью коррелирует с продукцией коагулазы.

Реагенты. Можно использовать коммерческие среды (ДН-аза Тест Агар; Термонуклеаза Агар; Thermal Агар) или готовить их самостоятельно.

1. ДН-аза Тест Агар:

Триптоза 20 г

ДНК 2 г

NaCl 5 г

агар 15 г

дистиллированная вода 1000 г

pH 7,3 0,2

Ход исследования.

Þ Ингредиенты растворяют в воде при слабом прогревании, автоклавируют среду при 121ºC 15 мин. и разливают в чашки Петри.

Þ Засевают культуру по поверхности застывшего агара в виде бляшки диаметром приблизительно 5 мм (на одной чашке можно исследовать несколько культур).

Þ Инкубируют 18-24 ч при 35-37ºC.

Þ Заливают поверхность агара 0,1 N соляной кислотой, через 2-3 мин кислоту сливают и учитывают результаты.

Интерпретация результатов. Появление зоны просветления вокруг роста культуры (деполимеризация ДНК), которая в 4 и более раз превосходит по ширине зону микробного роста (ширина последней должна

превышать 2-3 мм), свидетельствует о положительной реакции (в качестве эталонных штаммов можно использовать S.aureus АТСС 25923, Serratia marcescens АТСС 8100, S.pyogenes АТСС 19615); отсутствие или меньшая зона деполимеризации ДНК расценивается как отрицательная реакция и

учету не подлежит (эталонный штамм S.epidermidis АТСС 19615).

³ Тест можно использовать для идентификации Serratia marcens и M. Catarrhalis.

2.Альтернативный метод.

1,8% мясо-пептонный агар (МПА) 100 мл

ДНК высокополимерная 0,2 г

1% водный раствор метиленового синего 5 мл

10% раствор хлористого кальция ( ) 1 мл

pH 7,2-7,4

Þ Навеску ДНК помещают в пробирку и добавляют 0,2 мл 40% NaOH и 4-5 мл дистиллированной воды или физиологического раствора. Содержимое пробирки подогревают над пламенем горелки до полного растворения волокон ДНК.

Þ К расплавленному МПА добавляют к нему раствор ДНК и кипятят в водяной бане 15-20 мин.

Þ Агар остужают до 45ºC и добавляют к нему раствор метиленового синего и хлористого кальция, устанавливают pH.

Þ Приготовленную среду разливают по 12-15 мл в чашки Петри. Среда должна быть прозрачной, светло-синего цвета.

Þ Производят посев исследуемых культур стафилококка бляшками, диаметром 3-4 мм, и инкубируют 18-24 ч при 37ºC.

Þ Измеряют зоны просветления среды вокруг выросших культур, начиная от края макроколонии до синего ободка или конца зоны просветления.

Þ Положительным результатом считают зону просветления 5 мм. Дополнительным признаком принадлежности культуры к S.aureus считают наличие фиолетового диска вокруг макроколонии.