2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.1. Оксидазный тест.

Принцип. Определенные виды бактерий вырабатывают либо цитохромоксидазу, либо индофенолоксидазу (железосодержащий гемопротеин), которые катализируют перенос электронов от донаторов водорода (НАДН) к акцепторам (обычно кислороду). В оксидазном тесте бесцветный краситель p-фенилендиамин дигидрохлорид, используемый как искусственный акцептор электронов, при участии оксидазы окисляется и образует окрашенное вещество индофенол синий. Тест используют для первичной характеристики грам(-) бактерий. Особую помощь он оказывает при идентификации бактерий родов Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas, Campylobacter, Pasteurella, Neisseria.

Реагенты. Можно использовать готовые реагенты или готовить их в лаборатории. Для приготовления 1% раствора тетраметил-p-фенилендиамин дигидрохлорида добавляют 5 мл дистиллированной воды к 50 мг порошка реагента (заготовленные впрок навески реагента хранят в укупоренных пластиковых или стеклянных пробирках) и тщательно перемешивают. Реактив готовят ежедневно. Неиспользованный остаток реактива сбрасывают.

Коммерческие тесты представляют собой импрегнированные реагентом полоски или диски фильтровальной бумаги.

Контроль качества проводят в день постановки теста с культурами P. aeruginosa АТСС 27853 (положительный контроль) и E. coli АТСС 25922 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Прямой способ на чашках: Наносят 1 каплю реагента непосредственно на изучаемую колонию и наблюдают появление темно-фиолетового окрашивания.

Непрямой способ на фильтровальной бумаге.

Þ Помещают полоску (диск) фильтровальной бумаги в пустую чашку Петри и капают 1-2 капли реактива, либо используют готовые полоски, импрегнированные реагентом, и смачивают их деионизированной водой.

Þ Стерильным аппликатором или посевной петлей берут исследуемую колонию и размазывают ее по полоске или диску.

Þ При положительной реакции через 10-30 сек. Появляется окрашивание интенсивно синего или фиолетового цвета. При отрицательной реакции цвет не изменяется. При неопределенном результате, когда окрашивание появляется позже 30 сек., исследование необходимо повторить со свежей культурой (18-24-часовой). Как правило, грам (-) бактерии с замедленной оксидазной реакцией не принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, так как они не продуцируют фермент цитохромоксидазу.

Ограничения и предосторожности.

1) Нельзя использовать для посева культуры петли или проволоку из нержавеющей стали или нихрома, так как может наблюдаться ложно положительная реакция за счет образования продуктов окисления при обжиге петли в пламени для стерилизации.

2) Изучение бактерий, выросших на агаре МакКонки, Левина или других дифференциальных средах, не подходит для этого теста, так как индикаторы с этих сред могут дать ложно отрицательную реакцию.

3) Ложно отрицательная реакция может наблюдаться в смешанных культурах, относящихся к родам Pseudomonas и Neisseria, так как те виды Pseudomonas, которые вырабатывают оксидазу, также продуцируют некую ингибирующую субстанцию, влияющую на выработку оксидазы Neisseria spp.

4) Импрегнированную реагентом бумажную полоску после смачивания используют только 1 раз.

5) Результаты следует учитывать не более 30 сек.

6) Во избежание ошибок при выборе схемы идентификации оксидазный тест следует применять для всех грам (-) бактерий.