2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.1. Оксидазный тест.

2.2. Индольный тест.

2.3.Ферментация углеводов (“пестрый ряд”).

2.4.ONPG-тест.

2.5.Утилизация цитрата.

2.6.Утилизация малоната.

2.7.Тест с трибутирином (для идентификации M.catarrhalis).

2.8.Тесты декарбоксилирования и гидролиза аминокислот.

2.9.Фенилаланиновый тест.

2.10.Сероводородный тест (H2S-тест).

2.11.Гидролиз эскулина.

2.12.Уреазный тест.

2.13.Разжижение желатина.

2.14.Тест с метиловым красным.

2.15.Тест Фогес-Проскауэра.

2.16.Редукция нитратов.

2.17.Окислительно-ферментативный (ОФ) тест.

 

 

К началу главы |    Далее

 

2.9. Фенилаланиновый тест.

 

Принцип. Дезаминирование аминокислоты фенилаланина ведет к образованию фенилпировиноградной кислоты, которая при взаимодействии с хлорным железом образует цикличное соединение зеленого цвета. Среди членов семейства Enterobacteriaseae только Morganella spp., Proteus spp., Providencia spp., Enterobacter agglomerans (20% штаммов), Enterobacter sakazakii (50% штаммов), Rahnella aquatilis и Tatumella ptyseos способны дезаминировать фенилаланин. Еще меньше бактерий, обладающих этим признаком, среди неферментирующих грам(-) микроорганизмов.

 

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческие среды или приготовленные самостоятельно.

1.     Агар с фенилаланином:

L-фенилаланин                                                                                  2 г

дрожжевой экстракт                                                                    3 г

NaCl                                                                                                  5 г

натрия фосфат двузамещенный ()                                1 г

агар                                                                                                  12 г

дистиллированная вода                                                                1000 мл

Конечная pH 6,9

Þ          Растворяют ингредиенты в воде при слабом нагревании.

Þ          Разливают по 4 мл в пробирки.

Þ          Автоклавируют при 121° 15 мин.

Þ          Остужают среду в наклонном положении пробирок.

Среда сохраняет стабильность 2-3 мес. при хранении в холодильнике (2-8°C).

2.     Раствор N1:

калия фосфат однозамещенный ()                               38 г

дистиллированная вода                                                              500 мл

3.     Раствор N2:

натрия фосфат двузамещенный ()                           39 г

дистиллированная вода                                                            500 мл

4.     Рабочий раствор (0.1М фосфатный буфер):

Раствор N1                                                                                12 мл

Раствор N2                                                                                49 мл

Дистиллированная вода                                                           439 мл

5.     Забуференный раствор фенилаланина:

L-фенилаланин                                                                         0,2 г

0,1М фосфатный буфер                                                        100 мл

pH 7,4

Þ          Растворяют L-фенилаланин в рабочем буфере и стерилизуют фильтрованием.

Þ          Разливают по порциям 0,5 мл в стерильные пробирки.

Þ          Субстрат стабилен 6 мес. при 2-8°C.

1.     Приготовление раствора хлористого железа:

хлористое железо ()                                                  12 г

дистиллированная вода                                                     94,6 мл

соляная кислота, концентрированная (37%)                 5,4 мл

Þ          Растворяют соль в воде и медленно добавляют соляную кислоту в вытяжном шкафу (никогда не добавляют воду в кислоту!)

Þ          Стабильность раствора варьирует. Реагент не используют, если с положительной культурой отмечается слабая или отрицательная реакция. Хранят при 2-8°C.

 

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами P. vulgaris АТСС 33420 (положительный контроль) и E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль).

 

Ход исследования.

Þ          Стерильной петлей касаются нескольких колоний и засевают по поверхности скошенного агара.

Þ          Посевы инкубируют при 35-37°C 18-24 ч.

Þ          Добавляют 0,5 мл (5 капель) реагента  на растущую на скошенном агаре культуру.

Þ          Аккуратно поворачивают пробирку, чтобы реагент покрыл всю поверхность агара, и оценивают результат.

Þ          При положительной реакции появляется интенсивное окрашивание зеленого цвета; при отрицательной реакции косой агар или раствор (см. ниже) желтого цвета.

      Экспресс-метод:

Þ          Готовят густую суспензию (приблизительно N2 по стандарту мутности МакФарланда) исследуемой культуры в 0,5 мл забуференного раствора фенилаланина.

Þ          Инкубируют при 37°C 60 мин.

Þ          Добавляют 0,1 мл реагента , встряхивают 30 сек. И учитывают результат.

 

Ограничения и предосторожности.

1)         Положительная реакция исчезает через 10 мин. после добавления ; если добавить еще реагента, цвет восстановится.

2)         Некоторые виды микроорганизмов быстро дезаминируют фенилаланин, поэтому положительная реакция может наступить через 4 часа, что оправдывает применение экспресс-метода.

3)         Мясной экстракт или белковый гидролизат не могут заменить дрожжевой экстракт, так как концентрация содержащегося в них натурального фенилаланина варьирует.