2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.4. ONPG-тест.

Принцип. Ферментация лактозы, выявляемая традиционным методом, происходит при участии двух ферментов: пермеазы, обеспечивающей перенос молекулы лактозы внутрь бактериальной клетки, и b-галактозидазы, осуществляющей расщепление лактозы на галактозу и глюкозу. Не ферментирующие лактозу бактерии лишены обоих ферментов. Однако некоторые микроорганизмы испытывают дефицит пермеазы, но сохраняют способность синтезировать b-галактозидазу. ONPG ( O-нитрофенил-b-D-галактопиранозид), бесцветный субстрат, по своей структуре сходен с лактозой и в присутствии b-галактозидазы расщепляется на галактозу и O-нитрофенил, компонент желтого цвета. Этот тест используется для выявления бактерий со скрытой способности ферментировать лактозу, что является дифференциальным признаком членов семейства Enterobacteriaceae.

Среды и реагенты. Рекомендуется использовать коммерческие наборы из-за сложности самостоятельного приготовления реагентов, включающего несколько этапов.

1. Приготовление пептонной воды:

пептон 1 г

NaCl 0,5 г

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Растворяют пептон в воде и автоклавируют при 121°C 15 мин.

2. Приготовление натрий-фосфатного буфера (1 М, pH 7,0):

натрия фосфат двузамещенный () 13,8 г

дистиллированная вода 90 мл

Þ Растворяют соль в 50 мл воды, прогретой до 37°C, в мерных флаконах объемом 100 мл.

Þ В вытяжном шкафу медленно добавляют около 15 мл 5N NaOH, достигая pH 7,0.

Þ Во флакон доливают дистиллированную воду до отметки 100 мл.

3. Приготовление раствора ONPG (0,75 M ):

ONPG (Sigma, США) 0,6 г

натрий фосфатный буффер 0,5 г

Þ K натрий-фосфатному буферу добавляют ONPG и стерилизуют фильтрованием.

Þ Раствор остается стабильным 3 мес при хранении в стерильных затемненных стеклянных флаконах при 2-8°C.

4. Приготовление ONPG-бульона:

Þ Добавляют 25 мл раствора ONPG к 75 мл пептонной воды с соблюдением правил асептики.

Þ Разливают по 0,5 мл бульона в стерильные пробирки.

Þ Субстрат сохраняет стабильность в течение 1 мес. при хранении в морозильной камере (-20°С).

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами E.coli АТСС 25922 (положительный контроль) и P.mirabilis АТСС 29245 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Þ ONPG-бульон прогревают в водяной бане при 37°С для растворения кристаллов соли, образующихся при замораживании субстрата.

Þ Стерильной петлей или деревянной палочкой берут несколько сходных колоний на плотной среде для приготовления густой (цвета молока) бактериальной суспензии (соответствует стандарту мутности МакФарланда N2).

Þ Инкубируют смесь при 35°C не менее 1 часа и до 24 ч, периодически оценивая результат.

Þ При положительной реакции появляется желтое окрашивание (у некоторых организмов уже через 5-10 мин; например, у E.coli); при отрицательной реакции цвет среды не изменяется в течение всего срока наблюдения (24 ч).

Ограничения и предосторожности.

1) Чтобы ускорить появление положительной реакции следует использовать для посева густую взвесь инокулята.

2) Если ONPG-раствор недостаточно забуферен, может наблюдаться ложно положительная или ложно отрицательная реакция.

3) Так как глюкоза ингибирует активность b-галактозидазы, растущие на глюкозосодержащих средах бактерии проявляют меньшую активность, чем те организмы, которые растут на средах с лактозой.

4) Субстрат не используют, если еще до посева он имеет желтый цвет.

5) ONPG-тест не используют для дифференциации микроорганизмов, продуцирующих желтый пигмент.