2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.10. Сероводородный тест (-тест).

Принцип. Некоторые организмы способны к ферментативному высвобождению серы из серосодержащих аминокислот или неорганических соединений. Образующийся при взаимодействии с водородом может реагировать с некоторыми солями железа и свинца, являющимися индикаторами сернистых соединений, с образованием нерастворимых преципитатов сернистого железа или сернистого цинка, окрашенных в черный цвет. Чувствительность разных индикаторов варьирует. Из них наиболее чувствительный ацетат свинца, который может улавливать незначительные количества сероводорода, продуцируемого бактериями. А поскольку все члены семейства Enterobacteriaceae способны в разной степени образовывать сероводород, в рутинный практике лучше использовать менее чувствительные тесты для этих организмов, например, тройной сахарный агар с железом (ТСА) и агар Клиглера. Некоторые среды для кичешных бактерий (сальмонелла-шигелла агар, Гектоен энтероагар, лизин-декарбоксилазный агар) также способны выявлять .

Среды и реагенты. Обычно используют готовые или сухие коммерческие среды, прописи которых варьируют в зависимости от фирмы-изготовителя. Для определения применяют также полоски фильтровальной бумаги, пропитанные ацетатом цинка.

Приготовление индикаторных полосок с ацетатом свинца:

ацетат свинца 30 г

натрия гидрокарбонат 1 и

дистиллированная вода 100 мл

Нарезают узкие полоски фильтровальной бумаги, пропитывают их приготовленным раствором и высушивают.

Ход определения

· Полоски с ацетатом свинца помещают в пробирку с посевом так, чтобы они свободно свисали приблизительно на 2,5 см, не касаясь поверхности среды. Другой конец полоски находится снаружи, а полоска поддерживается пробкой пробирки.

· Посевы инкубируют при 35-37°C 18-24 ч (для некоторых организмов необходима более длительная инкубация).

· При положительном результате конец полоски окрашивается в черно-коричневый цвет; при отрицательном результате окрашивание отсутствует.

Ограничения и предосторожности.

1) Полоски с ацетатом свинца в 10 раз более чувствительны, чем культуральные методы определения сероводорода.

2) Ацетат свинца токсичен для роста бактерий, поэтому полоски следует использовать с осторожностью и не давать им соприкасаться со средой.

Тройной сахарный агар с железом (среда Олькеницкого) является дифференциальной средой для грам(-) бактерий на основе определения их сахаролитической активности и образования сероводорода.

Состав среды Олькеницкого:

питательный агар, pH 7,2-7,4 25 г

аммоний-железо (II) сульфат (соль Мора) 0,2 г

натрий тиосульфат (гипосульфит) 0,3 г

лактоза 10 г

сахароза 10 г

глюкоза 1 г

мочевина 10 г

дистиллированная вода 1000 мл

феноловый красный 0,4% водный раствор 4 мл

Þ Расплавляют 25 г сухого питательного агара в 1 л дистиллированной воды и остужают до 50°C.

Þ Соль Мора и гипосульфит растворяют в дистиллированной воде в пробирке.

Þ Углеводы и мочевину растворяют в дистиллированной воде в колбе на водяной бане.

Þ Готовят раствор индикатора: 0,1 г фенолового красного растворяют в 25 мл стерильной дистиллированной воды. Раствор может сохраняться в холодильнике до 10 дней.

Þ Все ингредиенты добавляют к расплавленному агару, размешивают и фильтруют через стерильную марлю, устанавливают pH 7,2-7,4.

Þ Вносят индикатор и разливают по 5-6 мл в пробирки.

Þ Стерилизуют при 112°C 20 мин.

Þ Пробирки помещают в наклонном положении для застывания агара в виде “скошенного столбика”: столбик высотой 2,5 см и скошенная часть длиной 4 см.

Ход исследования.

Þ Посев культуры производят петлей уколом в столбик и штрихом по скошенной поверхности.

Þ Посевы инкубируют при 37°C 18-20 ч.

Интерпретация результатов.

Когда происходит ферментация глюкозы, скошенная поверхность агара и столбик среды окрашиваются в желтый цвет. Если микроорганизм ферментирует лактозу и/или сахарозу, скошенная часть остается желтой (кислая реакция), но если лактоза не расщепляется, скошенная часть приобретает красный цвет за счет восстановления щелочной реакции.

Микроорганизмы, не ферментирующие глюкозу, не изменяют pH и цвет среды, либо образуют щелочные продукты и среда остается красной. Образование выражается в почернении среды.

Агар Клиглера по составу соответствует вышеуказанной среде, но не содержит сахарозу и является более чувствительным для определения сероводорода.

Контроль качества.

Организм

Косяк/Столбик

Газ

Реакция

Цвет

E.coli

АТСС 25922

S.typhimurium

АТСС 14028

Shigella flexneri

АТСС 12022

P.aeruginosa

АТСС 21853

кислота/щелочь

щелочь/кислота

желтый/желтый¹

красный/желтый²

красный/желтый

красный/красный³

¹Ферментация глюкозы, сахарозы и/или лактозы,

²Ферментация только глюкозы.

³Отсутствие ферментации

Разрывы и трещины в столбике.

Черное окрашивание среды.

Ограничения и предосторожности.

1) Результаты посевов следует учитывать через 18-24 ч. Более ранний учет может вести к ложной оценке реакции кислота/кислота, а более поздний – реакции щелочь/щелочь.

2) Обильная продукция может маскировать реакцию на глюкозу. При такой ситуации глюкоза все равно ферментируется, если даже реакция не просматривается (определяют по образованию газа).

3) Агар Клиглера и среда Олькеницкого помогают в идентификации членов семейства Enterobacteriaceae, других грам(-) бактерий и разных грам(+) палочек.

4) На тройном сахарном агаре утилизация сахарозы может подавлять ферментный механизм образования . По этой причине некоторые микроорганизмы демонстрируют продукцию сероводорода на агаре Клиглера, но не на среде Олькеницкого.