2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.2. Индольный тест.

Принцип. Индол является одним из продуктов расщепления триптофана в процессе метаболизма бактерий. В средах, содержащих триптофан в достаточном количестве, индол можно обнаружить по его способности взаимодействовать с некоторыми альдегидами с образованием окрашиваемого соединения. Для этого можно использовать капельный тест, являющийся экспресс-методом, который особенно удобен для предварительной идентификации E.coli. Альтернативным способом определения индола является общепринятый пробирочный тест, требующий ночной инкубации посевов. В качестве индикаторов используют реактивы Ковача или Эрлиха (в последнем случае индол сначала экстрагируют ксиленом).

Среды и реагенты. Можно использовать любой бульон, содержащий триптофан: коммерческий пептон, панкреатический ферментативный гидролизат казеина, мяса, триптон (панкреатический перевар казеина). Из плотных сред – триптиказо-соевый агар и др.

1. Реактив Эрлиха

p-диметиламинобензальдегид 1г

этиловый спирт, 95% 95 мл

соляная кислота, концентрированная 20 мл

2. Реактив Ковача

p-диметиламинобензальдегид 10г

изобутиловый или изоамиловый спирт(абс.) 150 мл

соляная кислота, концентрированная 50 мл

· Растворяют альдегид в спирте при слабом нагревании.

· Под вытяжным шкафом медленно добавляют кислоту (никогда не добавляют спирт в кислоту) при постоянном помешивании. Следует помнить о токсичности соляной кислоты.

· Готовые реагенты должны быть бледно-желтого цвета.

· Реагенты сохраняют стабильность в течение 1 года.

· Хранят реагенты в холодильнике (2-8° С) в стерильных склянках из темного стекла.

Контроль качества. Проверяют каждую новую партию среды или реагента, используя эталонные культуры E.coli АТСС 25922 (положительный контроль) и P.aeruginosa АТСС 27853 (отрицательный контроль). В капельном тесте контроль проводят в день постановки реакции.

Ход исследования.

Капельный тест:

Þ Кладут полоску фильтровальной бумаги в отдельную чашку Петри и пропитывают бумагу реагентом.

Þ Стерильным аппликатором отбирают изолированные колонии ночной культуры с агаровой среды, содержащей триптофан.

Þ Растирают инокулят на фильтровальной бумаге и наблюдают за изменением цвета.

Þ При положительном результате с реактивом Ковача на бумаге в течение 30 сек. появляется яркое красно-розовое окрашивание. При отрицательной реакции бумага остается бесцветной.

Пробирочный тест:

Þ Стерильным аппликатором или посевной петлей отщепляют часть хорошо изолированной колонии и вносят в бульон, содержащий триптофан.

Þ Инкубируют посев при 35°C 18-24 ч.

Þ Переносят 2 мл бульонной культуры в отдельную пробирку.

Þ Добавляют 5 капель реактива Ковача по внутренней стенке пробирки. Если используют реактив Эрлиха, предварительно добавляют в пробирку 0,5 мл ксилена.

Þ Хорошо встряхивают пробирку и проверяют наличие розового окрашивания на границе между бульоном и реагентом.

Þ Если реакция отрицательная, культуру можно реинкубировать дополнительно 24 ч и затем повторить реакцию.

Þ При положительной реакции на границе реактива и бульона (или слоя ксилена) в течение нескольких секунд образуется ярко красное кольцо. При отрицательной реакции цвет не изменяется, либо слой ксилена приобретает ярко желтый цвет.

Ограничения и предосторожности.

1) Нельзя использовать агар Мюллера-Хинтона, так как триптофан разрушается при кислом гидролизе казеина, входящего в состав среды.

2) Среды, содержащие индикатор (например, МакКонки, Левина, Эндо), не подходят для проведения капельного теста, так как перенос индикатора вместе с культурой на бумажный фильтр, содержащий кислоту, может дать неопределенный результат.

3) Если получен смешанный рост на агаровой среде, колонии, отобранные для капельного теста, должны отстоять от колоний другого типа не менее чем на 5 мм, так как индол диффундирует в среду.

4) Пробирочный тест чувствительнее капельного теста, а экстрагирование индола ксиленом наиболее чувствительный метод.