2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.1. Оксидазный тест.

2.2. Индольный тест.

2.3.Ферментация углеводов (“пестрый ряд”).

2.4.ONPG-тест.

2.5.Утилизация цитрата.

2.6.Утилизация малоната.

2.7.Тест с трибутирином (для идентификации M.catarrhalis).

2.8.Тесты декарбоксилирования и гидролиза аминокислот.

2.9.Фенилаланиновый тест.

2.10.Сероводородный тест (H₂S-тест).

2.11.Гидролиз эскулина.

2.12.Уреазный тест.

2.13.Разжижение желатина.

2.14.Тест с метиловым красным.

2.15.Тест Фогес-Проскауэра.

2.16.Редукция нитратов.

2.17.Окислительно-ферментативный (ОФ) тест.

К началу главы | Далее

2.5. Утилизация цитрата.

Принцип. Некоторые микроорганизмы способны утилизировать в качестве единственного источника углерода цитрат, являющийся промежуточным метаболитом в цикле Кребса. Поскольку в среде с цитратом источником азота служат соли аммония, рост бактерий сопровождается ощелачиванием среды (pH >7,6) с изменением ее цвета в присутствии индикатора. Этот признак используется при дифференциации членов семейства Enterobacteriaceae и других грам (-) палочек.

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческий цитратный агар Симмонса или готовят его в лаборатории.

Цитратный агар Симмонса:

аммония фосфат однозамещенный ()1 г

калия фосфат двузамещенный () 1 г

NaCl 5 г

натрия цитрат 2 г

магнезии сульфат () 0,2 г

агар 15 г

бромтимоловый синий (индикатор) 0,018 г

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Растворяют ингредиенты в дистиллированной воде и разливают по 4 мл в пробирки.

Þ Автоклавируют при 121°C 15 мин.

Þ Остужают среду в наклонном положении пробирок.

Þ Среды маркируют с указанием даты приготовления.

Þ Среды сохраняют стабильность 3 мес и хранятся в холодильнике при 2-8°C. Изменение цвета индикатора свидетельствует о непригодности среды.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами Enterobacter cloacae АТСС 23355 (положительный контроль) и E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Þ Засевают изолированную колонию штрихами по скошенной поверхности агара (агар не прокалывают).

Þ Посевы инкубируют при 35°C 24 часа и вплоть до 4 дней (колпачки с пробирок снимают для повышения оксигенации).

Þ При положительном результате появляется рост на фоне интенсивного синего окрашивания скошенной поверхности агара. При отрицательном результате рост микроорганизмов отсутствует и среда не изменяет цвет.

Ограничения и предосторожности.

1) Если обильный рост культуры не сопровождается изменением цвета среды, результат расценивается как положительный. Однако исследование нужно повторить, уменьшив посевную дозу бактерий.

2) При посеве культуры не следует прокалывать агар, так как для роста микроорганизмов требуется доступ кислорода.

3) Во избежание ложно положительного результата за счет переноса субстратов со среды накопления микроорганизмов для посева не следует брать много культуры.