2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.7. Тест с трибутирином (для идентификации M.catarrhalis).

Принцип. M.catarrhalis вырабатывает фермент бутиратэстеразу, гидролизующий химический компонент трибутирин до бутировой кислоты, снижающей pH среды и изменяющий цвет индикатора фенолового красного с красно-оранжевого на желтый. В малом объеме среды и густом посеве культуры положительный результат наблюдают через 2-4 часа. Если в качестве субстрата использовать 4-метилумбеллиферил бутират (МУБ), фермент выявляется уже через 5 мин.

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческие диски, либо коммерческую среду Ремеля (Remel), которую можно приготовить в лабораторных условиях.

1. Приготовление агара с трибутирином (среда Ремеля):

L-цистин 0,5 г

NaCl 5 г

трибутирин 20 г

натрия сульфит () 0,5г

феноловый красный (индикатор) 0,017 г

агар 3,5 г

дистиллированная вода 1000 мл

Конечная pH 7,4

Þ Растворяют ингредиенты в воде при слабом нагревании и разливают по 3 мл в пробирки.

Þ Автоклавируют при 121°C 15 мин.

Þ Остужают среду в наклонном положении пробирок.

Þ Среды маркируют с указанием даты приготовления.

Þ Среды сохраняют стабильность 3 мес и хранятся в холодильнике при 2-8°C. Изменение цвета индикатора свидетельствует о непригодности среды.

2. Приготовление концентрированного МУБ-раствора:

МУБ (Sigma, США) 100 мл

диметилсульфоксид (Sigma, США) 10 мл

Тритон х-100 100 мл

Þ Растворяют МУБ в растворе диметилсульфоксида с тритоном с-100.

Þ Разводят концентрированный МУБ-раствор в 10 раз цитратным буфером:

0,1 М лимонная кислота

0,05 М натрия фосфат однозамещенный ()

Конечная pH 5,0

Þ Разливают по 250 мкл в стерильные пробирки.

Þ Субстрат стабилен до 1 мес. в условиях хранения ниже -20°C.

Контроль качества осуществляется с эталонными культурами М.catarrhalis АТСС 25238 (положительный контроль) и N.lacunata АТСС 23970 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Агаровый метод.

Þ Засевают каждую пробирку густым инокулятом из нескольких сходных колоний, тщательно смешивая организмы петлей на скошенной поверхности агара.

Þ Посевы инкубируют при 35°C 2-4 часа; реинкубируют 24 ч при отрицательном результате (отсутствие изменения цвета среды). При положительном результате появляется желтое окрашивание.

МУБ-метод.

Þ Оттаивают пробирки с субстратом при комнатной температуре.

Þ Инокулируют субстрат организмами из нескольких сходных колоний (достаточно двух крупных колоний).

Þ Посевы инкубируют при 35°C 5 мин.

Þ Наличие флюоресценции (положительный результат) определяют в УФ-свете (360 нм); при отрицательном результате флюоресценция отсутствует.

Метод дисков.

Þ Смачивают диск каплей стерильной дистиллированной воды.

Þ Стерильной иглой или деревянной палочкой касаются нескольких колоний и растирают инокулум по поверхности диска.

Þ Инкубируют при комнатной температуре 5 мин; реакция обычно наступает через 2 мин.

Þ При положительном результате появляется сине-зеленое окрашивание; при отрицательном результате диск остается бесцветным.

Ограничения и предосторожности.

1) При недостаточной посевной дозе бактерий время появления реакции удлиняется, иначе можно получить ложно отрицательный результат. Для получения быстрой реакции используют густой инокулят.

2) Некоторые виды Pseudomonas и Staphylococcus гидролизуют трибутирин, поэтому перед тестированием изолятов необходимо подтвердить их морфологию при микроскопии. Тест проводят только с оксидазо(+), грам(-) диплококками, если имеется подозрение на их принадлежность к M.catarrhalis.