2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.14. Тест с метиловым красным.

Принцип. Этот количественный тест используется для определенной концентрации ионов (pH) в среде у ферментирующих глюкозу микроорганизмов. Все члены семейства Enterobacteriaceae преобразуют глюкозу в пировиноградную кислоту по метаболическому пути Эмбдена-Мейергофа. Дальнейшее превращение пировиноградной кислоты у одних бактерий происходит по смешанному кислотному пути с образованием кислых продуктов (молочной, уксусной, формоловой кислоты), обеспечивающих кислый потенциал среды (pH<4,4), у других – по бутиленгликолевому пути с образованием нейтральных продуктов, ацетоина и бутанодиола, повышающих потенциал среды ближе к нейтральному (pH>6,0). Используемый в данном тесте индикатор метиловый красный окрашивает среду в красный цвет при pH<5,0 и в желтый цвет при pH>5,8. Большинство энтеробактерий используют какой-либо один путь конечного превращения глюкозы, что позволяет дифференцировать их с помощью этого теста.

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческие среды или приготовленные самостоятельно (среда Кларка).

1.Приготовление бульона:

пептон 5 г

глюкоза 5 г

калия фосфат двузамещенный () 5 г

дистиллированная вода 1000 мл

Конечная pH 6,9

Þ Растворяют ингредиенты в воде при слабом нагревании.

Þ Разливают по 5 мл в пробирки.

Þ Автоклавируют при 121º 15 мин или стерилизуют дробно 3 дня подряд текучим паром.

Þ Среда сохраняет стабильность 2-3 мес при хранении в холодильнике (2-8ºC).

2.Приготовление индикатора.

метиловый красный 0,1 г

этиловый спирт 95% 300 мл

дистиллированная вода 200 мл

Þ Растворяют краситель в спирте и разбавляют дистиллированной водой.

Þ Индикатор сохраняет стабильность 1 год, хранят при 2-8ºC.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами E.coli АТСС 25922(положительный контроль) и K.pneumoniae АТСС 13883 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Þ Стерильной петлей или деревянной палочкой касаются центра отдельной колонии и производят посев в бульон (5 мл).

Þ Посевы инкубируют при 35ºC не менее 48 часов.

Þ Переносят 2,5 мл бульонной культуры в отдельную пробирку (13х100 мм).

Þ Добавляют 5 капель индикатора и наблюдают за изменением цвета.

Þ При положительном результате среда красного цвета; при отрицательном результате среда желто-оранжевого цвета. Если реакция отрицательная, продолжают инкубацию оставшейся порции бульона без индикатора и повторяют тест через 18-24 ч.

Альтернативный микрометод.

· Инокулируют 0,5 мл бульона одной бактериальной колонией.

· Инкубируют при 35ºC 18-24 ч.

· Добавляют 1 каплю индикатора и наблюдают результат.

Ограничения и предосторожности.

1) Изменение количества пептона в среде может отразиться на результатах.

2) Увеличение концентрации глюкозы в среде не ускоряет наступление реакции, но применение микрометода сокращает сроки за счет увеличения экспозиции бактерий в кислородной атмосфере.

3) Если время инкубации недостаточно, можно получить сомнительный или ложно отрицательный результат.

4) Следует избегать избыточной посевной дозы, так как рост бактерий задерживается, если их концентрация в среде превышает кл/мл.