2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.3. Ферментация углеводов (“пестрый ряд”).

Принцип. Способность ферментировать углеводы до образования кислых метаболитов варьирует у разных бактерий, что позволяет проводить их дифференциацию и идентификацию. Специфические углеводы добавляют к основной среде, содержащей химический индикатор, который изменяет цвет среды под действием кислоты, образующейся при ферментации углевода.

Среды и реагенты. Можно использовать коммерческие среды с углеводами или готовить их самостоятельно, используя разные модификации.

1. Основной бульон с феноловым красным:

пептон 10 г

мясной экстракт (необязательно) 1 г

NaCl 5 г

феноловый красный (индикатор) 0,018 г

дистиллированная вода 1000 мл

Конечная pH 7,4

Þ Растворяют ингредиенты в дистиллированной воде при осторожном подогревании (если это необходимо).

Þ Автоклавируют при 121° 15 мин.

Þ Остужают до 45-50°C в водяной бане.

Þ К кратным объемам основного бульона по отдельности добавляют углеводы, стерилизованные фильтрованием, до конечной концентрации 0,5-1%.

Þ Разливают по 4-5 мл в стерильные пробирки, куда можно поместить стерильные “поплавки” (перевернутые вверх дном пробирки Durham) для определения газообразования.

Þ Среды сохраняют стабильность 3 мес и хранятся в холодильнике при 2-8°C. Изменение цвета индикатора свидетельствует о непригодности среды.

2. Модифицированный индикатор Андреде:

кислый фуксин 0,5 г

1 N NaOH 15-18 мл

дистиллированная вода 100 мл

Конечная pH 7,1-7,2

Þ Растворяют фуксин в воде и добавляют 15 мл NaOH (когда через несколько часов красный цвет изменится на коричневый, добавляют по каплям щелочь пока не установится необходимый соломенно-желтый цвет).

Þ Добавляют 10 мл pH-индикатора Андреде к 1 л основного бульона без фенолового красного.

Þ Доводят pH до 7,1-7,2 добавлением 1N NaOH.

Þ Автоклавируют при 115°C 20 мин.

Þ Остужают и добавляют по отдельности углеводы (см. п.1), разливают по 4-5 мл в пробирки и маркируют их.

Þ Срок годности 3 мес. при хранении в холодильнике (2-8°C).

Þ Изменение цвета среды свидетельствует о ее непригодности.

3. Полужидкая основная среда с феноловым красным.

Þ К основному бульону с феноловым красным добавляют 0,4-0,6% агара. Конечная pH 7,5.

Þ Помещают емкость с агаровой смесью на магнитную мешалку с подогревом и встряхивают при осторожном нагревании до полного растворения агара.

Þ Разливают по 4-5 мл в пробирки и автоклавируют при 121°C 15 мин.

Þ Маркируют и хранят в холодильнике не более 3 мес.

4. Цистин-триптиказовый агар:

цистин 0,5 г

триптиказа 20 г

агар 3,5 г

NaCl 5 г

натрия сульфит () 0,5 г

феноловый красный (индикатор) 0,017 г

дистиллированная вода 1000 мл

Конечная pH 734-7,6

Этапы приготовления среды аналогичны изложенным выше (п.3)

Можно использовать готовый сухой цистин-триптиказовый агар (4,3г растворяют в 1 л дистиллированной воды).

5. Приготовление основных (20%) растворов углеводов:

Þ Добавляют 20 г углевода к 100 мл дистиллированной воды.

Þ Стерилизуют фильтрацией через милипоровые фильтры (диаметр пор 0,2 мкм) или дробно стерилизуют текучим паром.

Þ Растворы стабильны 2-3 мес при хранении в холодильнике (2-8°C).

Þ Для приготовления рабочей концентрации углевода добавляют 0,25 мл 20% основного раствора в пробирку с 5 мл основной среды.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами Klebsiella pneumoniae АТСС 13883 и Proteus mirabilis АТСС 29245 (соответственно, положительный и отрицательный контроль для адонита, арабинозы, сорбита), Stenotrophomonas cepacia АТСС 17765 и Pseudomonas putrifaciens АТСС 8071 (соответственно, положительный и отрицательный контроль для глюкозы, лактозы, мальтозы, маннита, сахарозы, ксилозы).

Ход исследования.

Посев в жидкую среду.

Þ При использовании тампона окунают его в бульон с чистой культурой; при взятии культуры с агаровой среды тампон предварительно смачивают в физиологическом растворе или бульоне. Отжимают тампон о стенку пробирки, не касаясь углеводной среды, и наклоняют пробирку так, чтобы инокулят достиг среды.

Þ При использовании стерильной иглы, петли или деревянной палочки забирают колонии чистой культуры и погружают их в каждую пробирку с углеводной средой.

Посев в полужидкий агар.

Þ Стерильной иглой или деревянной палочкой берут колонию чистой культуры и производят посев путем прокола среды по центру на 3/4 ее глубины. Не рекомендуется использовать для посева петлю, так как это может сопровождаться ложным эффектом газообразования.

Общие замечания:

* Для короткого “ пестрого ряда” из 8-10 углеводов обычно достаточно одного инокулята. Если используются 15-20 сахаров, может понадобиться дополнительное взятие культуры для посева; при этом либо используют новый тампон, либо заново простерилизованную иглу или петлю.

* Нет необходимости в прожигании петли или иглы между посевами, поскольку перенос углеводов из одной пробирки в другую настолько незначителен, что это не отражается на конечном результате.

Þ Засеянные жидкие или полужидкие углеводные среды инкубируют при 35°C 18-24 ч; для некоторых микроорганизмов необходима более длительная инкубация.

Þ При положительной реакции с индикатором феноловым красным среда окрашивается в желтый цвет за счет образования кислоты; при отрицательной реакции среда защелачивается и остается красно-розового цвета.

Þ При положительной реакции с индикатором Андреде среда окрашивается в красно-розовый цвет; при отрицательной реакции цвет среды варьирует от желтого до бесцветного.

Ограничения и предосторожности.

1) Для контроля роста необходимо производить посев культуры в основную среду без углевода.

2) Если микроорганизмы не растут на основной среде, в каждую углеводную среду добавляют либо сыворотку, либо дрожжевой экстракт. При добавлении сыворотки ее предварительно инактивируют при 60°C в течение 1часа.

3) Концентрация углеводов в среде должна составлять 1% (салицина – 0,5%), что предотвращает обратное развитие (реверсию) реакции.

4) Если используют “поплавки”, достаточно ограничиться одним, поместив его в пробирку с глюкозой.

5) Перед посевом необходимо тщательно исследовать “поплавок” на наличие газа, так как любой, самый маленький пузырек газа расценивается как показатель газообразования.

6) “Поплавки” не применяются в полужидких средах, где образование газа проявляется разрывами среды, образованием пузырей или отделением среды от дна пробирки.