2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.6. Утилизация малоната.

Принцип. Тест основан на способности микроорганизмов утилизировать малонат в качестве основного источника углерода. Содержащаяся в среде в минимальном количестве глюкоза поддерживает рост микробов, которые не способны утилизировать малонат или соли аммония, но такие микроорганизмы не могут поддерживать щелочную pH, так как образующаяся при ферментации глюкозы кислота нейтрализует любое спонтанно появляющееся защелачивание среды. Только микробы, одновременно утилизирующие малонат натрия (источник углерода) и сульфат аммония (источник азота), способны свести на нет влияние метаболических кислот, продуцируя гидроксид натрия. При этом сдвиг pH в щелочную сторону ведет к изменению цвета индикатора бромтимолового синего с зеленого на голубой. Ферментирующие глюкозу малонат (-) бактерии изменяют цвет индикатора с зеленого на желтый. Большинство видов Enterobacter и Klebsiella утилизируют малонат натрия. Тест также используется для отличия S.arizonae (+) от других видов Salmonella (-).

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческую среду с малонатом или готовят в лаборатории.

Бульон с малонатом:

дрожжевой экстракт 1 г

аммония сульфат [)] 2 г

NaCl 2 г

натрия малонат 3 г

калия фосфат однозамещенный () 0,4 г

калия сульфат двузамещенный () 0,6 г

глюкоза 0,25 г

бромтимоловый синий (индикатор) 0,025 г

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Растворяют ингредиенты в воде при слабом нагревании и разливают по 3 мл в пробирки.

Þ Автоклавируют при 121°C 15 мин.

Þ Остужают среду и маркируют с указанием даты приготовления.

Þ Среды сохраняют стабильность 2-3 мес при 2-8°C. Изменение цвета индикатора свидетельствует о непригодности среды.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами K. pneumoniae АТСС 13882 (положительный контроль) и E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Þ Стерильной петлей или деревянной палочкой касаются центра изолированной колонии и незначительное количество культуры засевают в среду (конечная концентрация суспензии менее 0,5 по стандарту мутности МакФарланда).

Þ Посевы инкубируют при 35°C 18-24 часа и при отрицательном результате реинкубируют до 4 дней.

Þ При положительном результате среда окрашивается в синий цвет (щелочная реакция). При отрицательном результате первоначальный зеленый цвет среды не изменяется, либо она окрашивается в желтый цвет (кислая реакция за счет ферментации глюкозы).

Ограничения и предосторожности.

1) Некоторые утилизирующие малонат бактерии слабо продуцируют щелочь, поэтому следует сравнивать результаты с незасеянной средой.

2) Для некоторых микроорганизмов для стимуляции роста в среду необходимо добавлять дрожжевой экстракт и глюкозу.