2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.13. Разжижение желатина.

Принцип. Под влиянием фермента желатиназы, продуцируемой некоторыми организмами, входящих в состав среды желатин гидролизуется и утрачивает свойства геля. Этот тест используют для дифференциации членов семейства Enterobacteriaceae, а также неферментирующих грам(-) бактерий и анаэробов.

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческие среды или приготовленные самостоятельно.

Желатиновая среда:

мясной экстракт 3 г

пептон 5 г

желатин 120 г

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Растворяют желатин в воде при нагревании до 50ºC.

Þ Добавляют мясной экстракт и пептон и вновь нагревают до 50ºC.

Þ Доводят pH до 6,8-7,0.

Þ Разливают по 4-5 мл в пробирки.

Þ Автоклавируют при 121º 15 мин.

Þ Остужают среду и хранят при 2-8ºC.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами P.aeruginosa АТСС 10145 (положительный контроль) и E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Þ Стерильной посевной иглой касаются нескольких сходных колоний и производят прокол желатиновой среды строго по центру, не доходя приблизительно 1 см до дна пробирки.

Þ Посевы инкубируют при 35ºC 24-48 часов (параллельно инкубируют незасеянную среду в качестве контроля реакции). Для некоторых организмов срок инкубации достигает 14 дней.

Þ Результаты учитывают в разные интервалы времени, для этого пробирки помещают в холодильник или ледяную баню, не встряхивая их. Охлажденные пробирки аккуратно наклоняют для оценки степени затвердения или разжижения среды.

Þ При положительном результате среда остается жидкой после ее охлаждения; при отрицательном результате среда уплотняется при охлаждении (то же происходит и в контрольной пробирке).

Ограничения и предосторожности.

1) Гелеобразующие свойства желатина варьируют, поэтому нужно использовать в качестве контроля незасеянную желатиновую среду.

2) Поскольку желатин при 35ºC имеет жидкую консистенцию, учет результатов следует производить после охлаждения среды.

3) Часто рост бактерий и разжижение желатина отмечается на поверхности среды, поэтому встряхивание пробирок, когда они еще теплые, может привести к ложно отрицательному результату.