2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.15. Тест Фогес-Проскауэра.

Принцип. Этот тест основан на выявлении ацетоина (ацетил-метилкарбинол) – промежуточного продукта в превращении пировиноградной кислоты (образующейся при расщеплении глюкозы) по бутиленгликолевому пути. В присутствии кислорода и КОН ацетоин окисляется в диацетил, образующий соединение красного цвета. Чувствительность теста возрастает с добавлением α-нафтола перед добавлением КОН.

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческие среды или приготовленные самостоятельно.

1. В качестве основы используют среду Кларка.

2. Приготовление реагента А:

α-нафтол 5 г

этиловый спирт (абсолютный) 100 мл

Þ Растворяют α-нафтол в небольшом объеме спирта, переносят в мерный флакон и добавляют спирт до объема 100 мл (раствор должен быть почти бесцветным).

Þ Раствор сохраняет стабильность 1 год, хранят в темной посуде при 2-8ºC.

3. Приготовление реагента Б:

KOH 40 г

дистиллированная вода 100 мл

Þ Взвешивают КОН в мерной мензурке, добавляют немного воды и переносят мензурку в холодную водяную баню для предупреждения перегрева.

Þ Доводят объем до 100 мл.

Þ Раствор сохраняет стабильность 1 год, хранят при комнатной температуре в полиэтиленовых или покрытых парафином стеклянных бутылях.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами K.pneumoniae АТСС 13883 (положительный контроль) и E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Þ Стерильной петлей, иглой или деревянной палочкой касаются центра отдельной колонии и производят посев в бульон (5 мл).

Þ Посевы инкубируют при 35ºC не менее 48 часов.

Þ Переносят 2,5 мл бульонной культуры в отдельную пробирку (13х100 мм).

Þ Добавляют 0,3 мл (6 капель) реагента А (α-нафтол).

Þ Добавляют 0,1 мл (2 капли) реагента Б (40% КОН).

Þ Осторожно встряхивают пробирку и оставляют на 10-15 мин, а затем учитывают результат.

Þ При положительной реакции через 15 мин появляется красное (оттенки до розового) окрашивание; при отрицательной реакции окрашивание не происходит.

Альтернативный метод (с ночной инкубацией):

· Вносят в 0,5 мл бульона петлю бактериальной культуры.

· Инкубируют при 35ºC 18-24 ч.

· Добавляют реагент A (6 капель) и реагент Б (2 капли).

· Встряхивают пробирки, оставляют на 10-15 мин. и учитывают результат.

Быстрый метод:

Вносят в 0,2 мл бульона петлю бактериальной культуры.

Инкубируют при 35ºC 4 ч.

Добавляют реагент A и Б (2-3 капли каждого), хорошо встряхивая пробирки после каждого реагента

Оставляют на 10-15 мин. и учитывают результат.

Ограничения и предосторожности.

При длительной инкубации (более 3 дней) некоторые Фогес-Проскауэр(+) бактерии создают в бульоне кислую среду, что ведет к слабой положительной или ложно отрицательной реакции.

Большинство членов семейства Enterobacteriaceae дают противоположные результаты в тестах с метиленовым красным и Фогес-Проскауэра. Но в отдельных случаях (H.alvei, P.mirabilis) могут быть обе положительные реакции (часто замедленные).

Реагенты следует добавлять в установленной последовательности, нарушение очередности может вызвать ложно отрицательную реакцию.

Избыток КОН может имитировать слабо положительную реакцию за счет взаимодействия только с α-нафтолом и появления окрашивания медного оттенка.

Нельзя учитывать результат позднее 1 часа после добавления реагентов, так как может наблюдаться ложно положительная реакция за счет появления окрашивания медного цвета.