2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.11. Гидролиз эскулина.

Принцип. Эскулин является замещенным гликозидом, который гидролизуется некоторыми бактериями до глюкозы и эскулетина. Последний связывается с ионами железа в среде с образованием соединения черного цвета. Неизменный эскулин флюоресцирует в УФ-свете при длине волны 360 нм. При гидролизе эскулина флюоресценция исчезает и среда приобретает черный цвет.

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческую среду или готовят ее в лаборатории.

Модифицированный эскулиновый агар:

эскулин 1 г

цитрат железа 0,5 г

агаризованный сердечный настой, сухой 40 г

цитрат натрия 2 г

дистиллированная вода 1000 мл

Эскулиновый бульон:

настой сердечной мышцы, сухой 10 г

панкреатический перевар животных тканей, сухой 10 г

NaCl 5 г

эскулин 1 г

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Растворяют ингредиенты в дистиллированной воде при легком нагревании.

Þ Остужают до 55°C и доводят pH до 7,0.

Þ Разливают по 5 мл в пробирки.

Þ Автоклавируют при 121º 15 мин.

Þ Остужают агаровую среду в наклонном положении пробирок.

Þ Среды маркируют с указанием даты приготовления.

Þ Среды стабильны 3 мес и храняться в холодильнике при 2-8ºC.

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами Aeromonas hydrophila АТСС 7965 (положительный контроль) и P.aeruginosa АТСС 27853 (отрицательный контроль).

Ход исследования.

Þ Стерильной петлей или деревянной палочкой прикасаются к центру хорошо изолированной колонии и производят посев на скошенную поверхность эскулинового агара или бульон.

Þ Посевы инкубируют при 35ºC 18-24 часа.

Þ Обследуют посевы в УФ-свете (360 нм) с помощью лампы Вуда.

Þ При положительном результате среда не флюоресцирует и имеет черную окраску; при отрицательном результате наблюдается флюоресценция.

Ограничения и предосторожности.

1) Флюоресценцию лучше наблюдать в темной помещении.

2) В качестве отрицательного контроля (наличие флюоресценции) всегда используют незасеянную среду.