2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.17. Окислительно-ферментативный (ОФ) тест.

Принцип. Бактерии могут утилизировать глюкозу и другие углеводы разными метаболическими путями: у одних микроорганизмов превалирует процесс ферментации, у других – процесс окисления. Исследования в этом направлении позволили Хью и Лейфсону (1953) разработать простой метод дифференциации анаэробного и аэробного пути расщепления углеводов в условиях, способствующих слабому образованию кислоты. Низкое соотношение белка к углеводу в предложенной ими окислительно-ферментативной (ОФ) среде способствует нейтрализации слабо продуцируемых кислот щелочными продуктами метаболизма белка. Замена аминокислот в ОФ-среде пептоном позволяет уловить изменения pH даже при слабом окислении углеводов. Среда содержит бромтимоловый синий в качестве индикатора pH. Существует более чувствительная ОФ среда Кинга (1967), где для реакции требуется еще меньшая концентрация продуцируемой кислоты, а индикатором служит феноловый красный.

Среды и реагенты. Обычно используют коммерческие среды или приготовленные самостоятельно.

1. ОФ – среда Хью-Лейфсона:

пептон 2 г

D-глюкоза 10 г

агар 2,5 г

бромтимоловый синий (индикатор) 0,03 г

NaCl 5 г

калия фосфат двузамещенный () 0,3 г

дистиллированная вода 1000 мл

Окончательная pH 7,1

2. ОФ – среда Кинга:

Казитон 1 г

агар 3 г

феноловый красный 1,5% (индикатор) 1 мл

дистиллированная вода 1000 мл

Окончательная pH 7,4

Þ Ингредиенты растворяют в воде и доводят pH до указанных в прописях сред значений (ОФ-основа).

Þ Разливают во флаконы по 200 мл и автоклавируют при 121ºC 15 мин.

Þ Готовят 10% растворы углеводов (2 г углевода и 20 мл дистиллированной воды, стерилизуют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм; или дробно в кипящей водяной бане).

Þ Добавляют в асептических условиях 20 мл 10% раствора углевода во флаконы с 200 мл ОФ-основы (остуженной до 55ºC).

Þ Разливают в пробирки по порциям 5 мл.

Þ Среды сохраняют стабильность 2-3 мес. при хранении в холодильнике (2-8ºC).

Контроль качества осуществляют с эталонными культурами K.pneumonia АТСС 13883 (ферментирующие бактерии), P.aeruginosa АТСС 27853 (окисляющие бактерии) и M.osloensis АТСС 10973 (несахаролитические бактерии).

Ход исследования.

Þ Для каждой исследуемой культуры всегда используют две пробирки с ОФ-средой.

Þ Стерильной посевной иглой или деревянной палочкой касаются центра колонии и прокалывают среду 1-2 раза на глубину половины столбика агара.

Þ Заливают содержимое одной пробирки (с глюкозой) стерильным минеральным маслом или жидким парафином слоем в 1 см.

Þ Инкубируют обе пробирки при 35ºC и ежедневно проверяют в течение 72 часов (для медленно растущих бактерий может потребоваться более длительная инкубация).

Þ При положительной реакции, сопровождающейся образованием кислоты, цвет ОФ-среды меняется на желтый; при отрицательной реакции ОФ-среда не изменяет свой первоначальный цвет (Хью-Лейфсона – зеленый; Кинга – красный).

Трактовка результатов:

Результаты (цвет)

Характер

метаболизма

Эталонные

культуры

в пробирке без

масла

в пробирке под

маслом

Кислота (желтый)

Щелочь (зеленый

или красный)

Щелочь (зеленый или

красный)

Кислота (желтый)

Щелочь (зеленый или красный)

Окисление

Ферментация

Несахаролити-ческий (неокис-ляющие)

P.aeruginosa

K.pneumoniae

M.osloensis

Ограничения и предосторожности.

1) Кислая реакция, образуемая окисляющими бактериями, сначала появляется на поверхности ОФ-среды и постепенно распространяется в глубину. Там, где окисление слабое или замедленное, следует внимательно наблюдать за малейшими изменениями первичной щелочной реакции на поверхности ОФ-среды без масла, которые могут отсутствовать в течение нескольких дней. Важно не спутать с отрицательной реакцией.

2) Если бактерии не могут расти на ОФ-среде, в каждую пробирку с углеводом добавляют 2% сыворотки или 1% дрожжевого гидролизата для стимуляции роста.

3) Несахаролитические бактерии вызывают слабое ощелачивание ОФ-среды Хью-Лейфсона без масла (сине-зеленое окрашивание), но ОФ- среда под маслом не изменяет свой цвет (зеленый).