2. Методы идентификации грам (-) бактерий.

2.8. Тесты декарбоксилирования и гидролиза аминокислот.

Принцип. Декарбоксилазы воздействуют на карбоксильную группу специфической аминокислоты с образованием соответствующего аминного продукта. Для идентификации грам(-) бактерий в рутинной практике обычно изучают 3 аминокислоты: лизин, орнитин и аргинин, используя в качестве основы декарбоксилазную среду Мюллера. Декарбоксилирование лизина и орнитина ведет к образованию, соответственно, кадаверина и путресцина, а аргинин превращается в цитруллин в результате гидролиза. Контролем служит посев культуры в основную среду без аминокислоты. Так как реакция декарбоксилирования проходит в анаэробных условиях, среду в пробирках с лизином и орнитином после посева заливают сверху стерильным минеральным маслом, а затем инкубируют. Если организмы способны размножаться, в контроле и опыте цвет среды становится желтым за счет ферментации глюкозы, содержащейся в среде в незначительном количестве. При декарбоксилировании аминокислот образующиеся щелочные амины восстанавливают первоначальный темно-красный цвет индикатора в среде. Помимо идентификации членов семейства Enterobacteriaceae тесты используют для дифференциации представителей Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio и других неферментирующих грам(-) бактерий.

Среды и реагенты. Используют коммерческие среды или приготовленные в лаборатории.

(1) Основа среды:

пептон 5 г

дрожжевой экстракт (либо аутолизат дрожжей) 3 г (12-15 мл)

диализат дрожжей 12-15 мл

глюкоза 1 г

бромтимоловый синий, 1,6% спиртовой раствор 1 мл

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Основу среды делят на 3 части.

Þ Добавляют к одной части 1% L-лизина, ко второй части 1% L-орнитина; третью часть используют как контрольную (без добавления аминокислоты). При использовании DL-аминокислот их добавляют в концентрации 2%, так как энтеробактерии проявляют активность в отношении L-изомеров.

Þ Все порции среды разливают по 2-3 мл в серологические пробирки.

Þ Стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин.

Þ Готовая среда имеет светло-зеленый цвет.

Ход исследования.

Þ Посев производят минимальными дозами с косяка 16-18-часовой агаровой культуры в среды с аминокислотами и в контрольную среду.

Þ После посева во все пробирки вносят стерильное вазелиновое масло (слоем 4-5 мм) для получения более надежных и четких результатов.

Þ Посевы инкубируют при 37°C до 4-х дней (в большинстве случаев положительная реакция наблюдается через 1-2 дня).

При положительном результате среда приобретает синий цвет за счет накопления щелочных продуктов. При отрицательном результате цвет среды желтый. В контрольной пробирке должна быть желтая окраска среды (в результате подкисления среды за счет ферментации глюкозы).

(2) Основной бульон Мюллера:

пептон 5 г

мясной экстракт 5 г

бромкрезоловый пурпурный (индикатор) 0,01 г

крезоловый красный (индикатор) 0,005 г

глюкоза 0,5 г

пиридоксаль 0,005 г

дистиллированная вода 1000 мл

Þ Основной бульон делят на 4 равные порции (по 250 мл).

Þ Добавляют по одной аминокислоте (1% L-изомер или 2% DL-изомер, соответственно, аргинина, орнитина и лизина) в первую, вторую и третью порцию бульона; четвертую порцию оставляют без аминокислоты (контроль роста культуры).

Þ Доводят pH среды с орнитином до 6,0 перед стерилизацией, добавляя по каплям 1N NaOH.

Þ Разливают среды в пробирки по 3-4 мл.

Þ Автоклавируют при 121° 10 мин.

Þ Среды маркируют с указанием даты приготовления.

Þ Субстраты стабильны 3 мес при хранении в холодильнике при 2-8°C. Изменение цвета индикатора свидетельствует о непригодности среды.

Приготовление стерильного минерального масла:

Þ Добавляют 1 мл воды к 100 мл масла.

Þ Автоклавируют при 121°C 45 мин.

Контроль качества.

Амино-кислоты

Положительный контроль

Отрицательный

контроль

лизин

орнитин

аргинин

K.pneumoniae А ТСС13883

E.cloacae А ТСС23355

E.cloacae А ТСС23355

E.cloacae А ТСС23355

K.pneumoniae А ТСС13883

Ход исследования.

Þ Стерильной петлей или деревянной палочкой касаются одной колонии и производят посев в бульон Мюллера без аминокислоты.

Þ Таким же способом производят посев в бульон с аминокислотой.

Þ Наливают сверху среды с лизином и орнитином 4-5 мл стерильного минерального масла.

Þ Посевы инкубируют при 35°C до 4-х дней (в большинстве случаев положительная реакция наблюдается через 1-2 дня).

Þ При положительном результате появляются окрашивание с оттенками от размытого пурпурного до желто-пурпурного цвета. При отрицательном результате цвет среды ярко желтый. В контрольной пробирки среда сохраняет первоначальный цвет либо становится желтой за счет ферментации глюкозы (должно быть помутнение бульона, отражающее наличие роста).

Ограничения и предосторожности.

1) Контрольную среду следует засевать одновременно с аминокислотными средами.

2) Результаты оценивают только при наличии помутнения бульона.

3) При чередовании слоев желтого и пурпурного цвета пробирку слегка встряхивают, а уже потом учитывают результат.

4) Все положительные результаты сопоставляют с контрольной пробиркой. Серый цвет реакции скорее всего свидетельствует об ослаблении индикатора, который следует добавить в среду, прежде чем учитывать результаты.

5) На среде Мюллера результаты учитывают не ранее 18 ч инкубации.

6) После 24 ч инкубации любые среды пурпурного цвета в опытных пробирках расцениваются как положительный результат.

7) Небольшое количество хлопьевидного осадка в среде с орнитином не препятствует ее использованию.